Difracción de Rayos X

Aplicaciones en la industria farmacéutica

Aplicaciones farmacia

 

Determinar la estructura cristalina

La técnica de difracción de rayos X en monocristal permite elucidar la estructura de las moléculas de la red cristalina y, por tanto, proporciona la información clave para distinguir polimorfos. De hecho, el criterio establecido para la aceptación de la existencia de polimorfismo es la determinación de estructuras cristalinas no equivalentes.

Por ejemplo, la molécula de Paracetamol presenta dos polimorfos, FORMA I y FORMA II, que tienen diferentes estructuras cristalinas (Fig. 1), y por tanto, distintas propiedades físico-químicas.

Determinar estructura 1Fig. 1. Estructuras de la FORMA I (A) y FORMA II (B) de Paracetamol.

 

El conocimiento de la estructura es fundamental para poder entender las propiedades de cualquier agente farmacéutico.

  • FORMA I (monoclínica): Termodinámicamente estable, se usa comercialmente, tiene malas propiedades de compresión.
  • FORMA II (ortorrómbica): Metaestable, se transforma en la FORMA I, se puede comprimir directamente.

 

La FORMA I y la FORMA II presentan empaquetamientos cristalinos diferentes aunque en ambos casos las moléculas de cada polimorfo, se unen unas a otras a través de dos tipos de enlaces de hidrógeno, O-H···O=C (líneas discontinuas de color verde) y N-H···OH (líneas discontinuas de color amarillo), formando estructuras laminares (Fig. 2A y 2B).

En el empaquetamiento molecular de la FORMA I (Fig. 2A), las láminas están plegadas a lo largo del eje b, originando una construcción relativamente rígida por lo que las propiedades de compresión son pobres, y se requieren aglutinantes para formar pastillas.

Sin embargo, en el empaquetamiento molecular de la FORMA II (Fig. 2B), las láminas son paralelas al plano bc, dando lugar a planos de deslizamiento, los cuales permiten la deformación plástica. Por esta razón, las propiedades de compresión de la FORMA II son mejores que las de la FORMA I, y es posible la compresión directa.

Determinar estructura 2Fig. 2. Empaquetamiento cristalino de la FORMA I (A) y FORMA II (B) de Paracetamol mostrando dos tipos de enlaces de H.

 

Establecer configuración absoluta

La técnica de difracción de rayos X de monocristal permite diferenciar sin ambigüedad enantiómeros. Los enantiómeros son pares de estereoisómeros que son la imagen especular una de otra, y no son superponibles, exactamente igual que una mano derecha y una mano izquierda (Fig.1).

Establecer configuración 1Fig. 1. Ejemplo de enantiómeros.

La importancia de la estereoquímica es fundamental en la preparación de medicamentos o compuestos destinados a actuar sobre organismos. En la naturaleza es frecuente que dos compuestos enantiómeros que sólo difieren por su configuración espacial presenten una diferencia de actividad espectacular: por ejemplo, uno de ellos es activo y el otro puede ser una sustancia inactiva e incluso tóxica como sucede con la Talidomida (Fig. 2).

Establecer configuración 2Fig. 2. Enantiómeros de la Talidomida.

La Talidomida es un fármaco que se vendió como una mezcla racémica. Tragicamente, cuando la talidomida se suministró a mujeres embarazadas, éstas sufrían abortos espontáneos o nacían bebés con malformaciones congénitas. Las investigaciones pusieron de manifiesto que el enantiomero R tenía el efecto sedante pero el enantiómero S producía efectos tetarogénicos, por lo que el medicamento se retiró del mercado.

 

Generar difractograma teórico

El estudio estructural por difracción de rayos X de monocristal, proporciona datos cristalográficos (parámetros de celda unidad, grupo espacial, coordenadas atómicas, factores de ocupación) a partir de los cuales es posible generar un difractograma teórico de nuevos fármacos o medicamentos.

La molécula de Paracetamol presenta dos polimorfos según cristalice en el sistema monoclínico (FORMA I) o en el sistema ortorrómbico (FORMA II), cada uno de los cuales origina un difractograma teórico diferente (Fig. 1-2). El difractograma se puede considerar como la “huella dactilar” de la fase cristalina que lo ha producido, y usarse para su inequívoca identificación.

El difractograma teórico de un fármaco se puede comparar con el difratograma experimental obtenido para una muestra de polvo policristalino del mismo, por lo que es de gran utilidad para establecer si el producto analizado está puro o contiene impurezas.

Generar difractograma 1Generar difractograma 2

 

Distinguir polimorfos

El polimorfismo farmacéutico es la capacidad de un principio activo para presentar distintas estructuras cristalinas, y depende principalmente de las condiciones de presión y temperatura en la que se realiza la síntesis.

Este fenómeno es objeto de gran interés en la industria farmacéutica, debido a que los polimorfos aunque poseen idéntica composición química difieren en sus propiedades (biodisponibilidad, solubilidad, grado de disolución, estabilidad térmica, compresibilidad…) lo que puede afectar a la eficacia y seguridad del producto.

Por ejemplo, un fármaco con polimorfismo es el Manitol que se usa en la industria de alimentos como edulcorante especialmente en la dieta de diabéticos, y también en medicina como diurético osmótico o como un vasodilatador renal leve.

El Manitol presenta tres formas polimórficas (α, β y δ), cada una de las cuales adopta una estructura cristalina distinta (Fig. 1).

Distinguir polimorfos 1Fig. 1. Estructuras de las tres formas polimórficas de Manitol vistas a lo largo del eje c.

La difracción de rayos X en polvo policristalino es la técnica más útil para el estudio del polimorfismo de una muestra cristalina, ya que los patrones de difracción de los diversos polimorfos siempre presentan notables diferencias.

Las formas polimórficas originan distintos difractogramas de rayos X (varían las posiciones de los máximos de difracción, sus intensidades relativas, etc.), lo que permite distinguirlas de manera inequívoca (Fig. 2).

Distinguir polimorfos 2

Fig. 2. Difractogramas de las tres formas polimórficas de Manitol.

 

Identificar fases cristalinas

La difracción de rayos X de polvo policristalino se utiliza como herramienta en el campo farmacéutico para el control de calidad de medicamentos, permitiendo identificar el principio activo y los excipientes.

Cada fase cristalina siempre produce un patrón de difracción característico, por lo que este hecho es la base para el uso de la difracción como método de análisis químico. La identificación se realiza comparando el difractograma de la muestra a identificar, con los patrones experimentales almacenados en una base de datos de difracción de polvo (JCPDS-PDF 2)*.

*(JCPDS-PDF) : Joint Committee on Powder Diffraction Standards-Powder Diffraction File.

1. Ejemplo de identificación de un API

Identificar fases 1Fig. 1. Identificación de una fase cristalina de Paracetamol.

En la Fig. 1 se observa que las posiciones e intensidades de los máximos de difracción de la muestra analizada coinciden con los del patrón de Paracetamol (líneas verticales de color rojo), con fórmula empírica C8H9NO2 y tarjeta (JCPDS 39-1503).

2. Identificación de un API y dos excipientes

Identificar fases 2Fig. 2. Identificación de las fases cristalinas de una mezcla de Paracetamol, Silvina y Nahcolita.

En la Fig. 2 se observa una mezcla de fases cristalinas, en las cuales se identifica el principio activo Paracetamol, C8H9NO2, (líneas verticales de color rojo), con tarjeta (JCPDS 39-1503). Además, se identifican dos excipientes como son la Silvina, KCl, (líneas verticales de color azul) con tarjeta (JCPDS 04-0587) y la Nahcolita o bicarbonato de sodio natural, NaHCO3, (líneas verticales de color verde), con ficha (JCPDS 15-0700).

 

Detectar impurezas

El ajuste del perfil de difracción es de gran utilidad para poder detectar la presencia de impurezas en fármacos. Consiste en ajustar el difractograma experimental con respecto a un difractograma calculado, hasta obtener la menor diferencia entre ambos.

Cabe destacar que no se emplea ningún modelo estructural, y se refinan las variables que describen el perfil de difracción experimental (parámetro de desplazamiento del cero, parámetros de celda, anchura y forma de los picos, parámetros de fondo, etc.).

Para ver un ejemplo de esta aplicación, se ha refinado el perfil de difracción obtenido para una muestra policristalina de Hidrocloruro de Gemcitabina (C9H11F2N3O4 . HCl), que es un b-nucleosido con actividad antitumoral, cuya estructura se ha representado en la Fig.1.

Detectar impurezas 1Fig. 1. Estructura del compuesto C9H11F2N3O4 . HCl.

El refinamiento de los parámetros se ha realizado usando el programa Fullprof a través del programa WinPLOTR, que áctua como interfaz gráfica del primero, permitiendo visualizar en cada momento el difractograma experimental y calculado, así como su diferencia, lo cual resulta muy útil para saber si el ajuste está siendo correcto.

En la Fig. 2, se muestra el difractograma experimental en color rojo, en color negro el difractograma calculado, y en color azul la diferencia entre ellos. Las líneas verticales en color verde indican las posiciones de las reflexiones permitidas.

Detectar impurezas 2Fig. 2. Gráfica de Rietveld de la muestra de Hidrocloruro de Gemcitabina.

Los factores de acuerdo obtenidos del refinamiento indican que se ha logrado un buen ajuste entre el difractograma experimental y el calculado (Rp = 6.92, Rwp = 9.48, Rexp = 5.13, χ2 = 3.42). El ajuste de perfil revela que la muestra corresponde a una fase pura, no observándose ninguna reflexión atribuible a la presencia de impurezas.

 

Refinar estructuras cristalinas

El método de Rietveld consiste en realizar un ajuste por mínimos cuadrados del difractograma experimental con respecto a un modelo teórico, hasta obtener el mejor ajuste entre ambos.

En el modelo teórico se incluyen parámetros estructurales (parámetros de celda, grupo espacial, posiciones atómicas, factores de agitación térmica, factores de ocupación, etc.) y parámetros globales (factor de escala del difractograma, parámetros de fondo, desplazamiento del cero, parámetros para describir la forma de los picos, etc.).

Para ver un ejemplo de esta aplicación, se ha refinado la estructura de una muestra policristalina de un excipiente como es el Oxido de Zinc (ZnO), que en medicina se usa principalmente como antiséptico para ayudar a combatir o prevenir infecciones en caso de heridas. En la tabla 1, se recogen algunos parámetros estructurales de este compuesto usados para realizar el refinamiento con el programa FullProf.

Refinar estructuras 1Tabla. 1. Algunos parámetros estructurales para la fase ZnO.

En la Fig. 1, se observa el difractograma observado (rojo), el calculado (negro), así como la diferencia entre ellos (azul) para la muestra de ZnO. Las lineas verticales indican las posiciones de las reflexiones permitidas (verde).

Refinar estructuras 2Fig. 1. Gráfica de Rietveld de la muestra de ZnO.

Los factores de acuerdo obtenidos del refinamiento indican que se ha logrado un buen ajuste entre el difractograma experimental y el modelo teórico Rp = 3.83, Rwp = 5.84, Rexp = 2.93, χ2 = 3.97).

 

Análisis cuantitativo

El método de Rietveld representa una potente herramienta para el análisis cuantitativo de fases a partir de difractogramas de polvo. Se requiere realizar un análisis cualitativo previo y disponer de información estructural completa de todas las fases (parámetros de celda, grupo espacial, posiciones atómicas, etc.).

A modo de ejemplo, se ha utilizado el método de Rietveld para realizar un análisis cuantitativo de una sal hiposódica comercial, constituida por una mezcla de dos excipientes, los cuales se han identificado como Halita (JCPDS 05-0628) y Silvina (JCPDS 04-0587) en el difractograma de la Fig. 1.

Análisis cuantitativo 1Fig. 1. Identificación de las fases cristalinas de una mezcla de Halita y Silvina.

En la Tabla 1, se recoge la información cristalográfica fundamental para realizar el refinamiento de la estructura cristalina de las dos sales (NaCl y KCl) presentes en la muestra.

Análisis cuantitativo 2Tabla 1. Algunos parámetros estructurales para las fases NaCl y KCl.

En la Fig. 2, se observa el difractograma observado (rojo), el calculado (negro), así como la diferencia entre ellos (azul) para la mezcla de NaCl y KCl. Las lineas verticales indican las posiciones de las reflexiones permitidas (verde).

Análisis cuantitativo 3Fig. 2. Gráfica de Rietveld de la mezcla comercial de sales constituida por NaCl y KCl.

Los valores de los factores de acuerdo obtenidos del refinamiento son: Rp = 6.63, Rwp = 10.302, Rexp = 6.85, χ2 = 2.20, RB = 5.95 para la fase NaCl y RB = 1.08 para la fase NaCl. Los resultados del análisis cuantitativo determinaron que la mezcla de sales, está constituida por un 74.47 % en peso de KCl y un 25.53 % en peso de NaCl.

 

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