Secuenciación de ADN

Equipamiento

SECUENCIADOR AUTOMÁTICO CAPILAR 3100 GENETIC ANALYZER (APPLIED BIOSYSTEMS)

El servicio está equipado con un secuenciador automático capilar 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) que se complementa con una amplia y moderna instrumentación auxiliar. Con este equipo se pueden llevar a cabo secuenciaciones tipo Sanger de cualquier clase de ADN y análisis de fragmentos de ADN.

SISTEMA DE ULTRASECUENCIACIÓN ROCHE FLX-454

A este equipo se le une el sistema de Ultrasecuenciación (Roche FLX-454), junto con todo el equipamiento accesorio que convierte a la Universidad de Salamanca en una de las pocas instituciones en España que cuentan con esta moderna tecnología.

Con este equipo se puede secuenciar cualquier molécula de ADN, lo que permite abarcar gran cantidad de aplicaciones, entre las que cabe destacar:

  • Secuenciación de novo de genomas completos (Procariotas y pequeños Eucariotas).
  • Secuenciación de novo del transcriptoma.
  • Secuenciación de amplicones.
  • Secuenciación de ADN ancestral.
  • Metagenómica.
  • Captura de secuencias.
  • Chip-seq/Metylation/Epigenética.

 

PLATAFORMA C1 SINGLE-CELL AUTO PREP ARRAY (FLUIDIGM)

Permite la extracción, amplificación y preparación de ácidos nucleicos de célula individual para posteriores aplicaciones.

  • Extracción de ADN de célula única para posterior genotipado.
  • Extracción de ADN, amplificación y preparación de librerías de célula única para secuenciación por tecnología Ilumina.
  • Extracción, trascripción y amplificación de ARN para estudios de expresión (DeltaGene y TaqMan).
  • Extracción, retrotrascripción y amplificación de ARN para secuenciación de ARN mensajero (Illumina).
  • Extracción, retrotrascripción y amplificación de ARN para secuenciación de microARN (Illumina).

 

TERMOCICLADOR BIOMARK HD (FLUIDIGM)

Análisis de genotipado o expresión génica en formato tipo “array” de 48x48, 96x96 y bloque flexible de 6x6. Además permite la realización de PCR digital.

Es perfectamente compatible con el material genético obtenido tras el procesamiento de “célula individual” de la plataforma C1.

  • Genotipado
  • Análisis panel de SNPs
  • Expresión génica RNA y microRNA (DeltaGene y TaqMan)
  • Determinación de CNV (Copy number variation)
  • Análisis de LOH (pérdida de heterocigosidad)

 

REQUERIMIENTOS PARA EL 3100 GENETIC ANALYZER (APPLIED BIOSYSTEMS)

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

El ADN ha de estar limpio y libre de contaminantes como sales, ARN o proteinas.

Para plásmidos la utilización de sistemas de purificación mediante columnas suelen ir bien para su posterior secuenciación. Si se utilizan métodos en que se precipita el ADN con etanol, es muy importante lavar el precipitado con etanol al 70%.

Para los productos de PCR es aconsejable separarlos en un gel de agarosa y la banda de interés debe ser recortada y el ADN extraido (elución, Geneclean, kit con columnas etc). Otro método sencillo es el de la Exo-SAP siempre que la banda sea única.

IMPORTANTE: resuspender el ADN siempre en agua estéril

CANTIDAD DE ADN REQUERIDA

La cantidad de ADN junto con la pureza de la muestra, son los factores más importantes que afectan a la caliad de los resultados. Si utilizamos una cantidad insuficiente de ADN, los resultados serán de mala calidad, pues la intensidad o altura de los picos del cromatograma serán muy bajos, pudiendose enmascarar con el ruido de fondo (picos inespecificos). Si la cantidad es excesiva, la secuencia no alargará lo suficiente pues los oligonucleótidos cebadores se terminarán en los primeros ciclos. Así pues es necesario una relación equilibrada de ADN molde y cebadores.

CONSEJO IMPORTANTE: una vez extraido el ADN es muy importante cuantificarlo cargando una alicuota en un gel de agarosa junto a un control de concentración conocida. Esto nos ayudará a calcular la concentración de ADN así como a estimar su calidad, podemos ver por ejemplo si está libre de ARN.

La cantidad de ADN aconsejada para una reacción de secuencia es la siguiente:

  • plasmídico: 400-600 ng.
  • cósmidos, BAC y otros plásmidos grandes: 1-2 µg.
  • productos de PCR: depende del tamaño de la banda a secuenciar. Una regla que funciona bien es utilizar 100 ng para una banda de longitud igual a 1 kb.

 

La cantidad de oligonucleótido cebador para una reacción de secuencia es de 3.2 pmol.

Los volumenes en que deben ir las cantidades mencionadas anteriormente se detallan en el apartado de envio de muestras.

IMPORTANTE: resuspender el ADN y el cebador siempre en agua estéril.

ENVIO DE LAS MUESTRAS

Como norma general las muestras deben llegar al Servicio de Secuenciación siguiendo las siguientes pausas:

  • Se utilizarán tubos eppendorf de 1.5 ml.
  • El nombre de la muestra debe rotularse en la tapa del tubo y debe ser de forma sencilla, sin muchas letras (no mas de 6 caracteres) y evitar rotuladores que se borren facilmente.
  • En cada eppendorf con muestra debe ir el ADN molde y el cebador necesarios para una reacción de secuencia, siempre resuspendidos en agua y en un volumen fijo de 8 µl.
  • El servicio dispone de algunos cebadores los cuales pueden ser añadidos por el propio servicio a las muestras de ADN previa petición por parte del usuario sin costo alguno. Los cebadores de los que se disponen son:
    • Universal (M13 forward): 5' TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3'
    • Reverso (M13 reverse): 5' AAC AGC TAT GAC CAT G 3'
    • Oligo T7: 5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3'
    • Oligo SP6: 5' TAT TTA GGT GAC ACT ATA G 3'
    • Oligo T3: 5' ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3'

 

Cuando sea el servicio quien añada los cebadores, en el eppendorf de la muestra sólo se entregará el ADN molde necesario en un volumen fijo de 5 µl en agua.

  • Las muestras pueden llevarse directamente al servicio de secuenciación. Aquí existe un cuaderno donde debe apuntarse al menos los datos siguientes:

    • Fecha de entrega de la muestra.
    • El nombre del usuario y dirección de e-mail.
    • Número y nombre de las muestras.
    • Si es necesario que se le añada el cebador debe notificarlo.
  • Las muestras se colocarán en el congelador del que dispone el servicio, utilizando el cajón superior. El personal técnico del servicio orientará al usuario en caso de necesidad.
  • También podrán enviarse las muestras por correo ordinario o urgente. En este caso sería aconsejable enviar muestra suficiente como para realizar tres reacciones de secuenciación por si hubiese que repetir alguna. Se enviaría pues 24 µl con la cantidad de ADN y cebador necesario. También es posible enviar la muestra liofilizada. En cualquier caso las muestras deben ir acompañadas con la información requerida como nombre y e-mail del usuario, fecha de envio de las muestras, número y nombre de las mismas.

 

Las secuencias se enviarán al Servicio de Secuenciación de ADN, edificio Departamental, Avenida del Campo charro S/N, 37007 Salamanca.

PARA UTILIZAR EL SECUENCIADOR 454 ES NECESARIO CONTACTAR CON EL SERVICIO ANTES DE ENVIAR LAS MUESTRAS.

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