Secuenciación de ADN
SECUENCIADOR AUTOMÁTICO CAPILAR 3100 GENETIC ANALYZER (APPLIED BIOSYSTEMS)
El servicio está equipado con un secuenciador automático capilar 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) que se complementa con una amplia y moderna instrumentación auxiliar. Con este equipo se pueden llevar a cabo secuenciaciones tipo Sanger de cualquier clase de ADN y análisis de fragmentos de ADN.
SISTEMA DE ULTRASECUENCIACIÓN ROCHE FLX-454
A este equipo se le une el sistema de Ultrasecuenciación (Roche FLX-454), junto con todo el equipamiento accesorio que convierte a la Universidad de Salamanca en una de las pocas instituciones en España que cuentan con esta moderna tecnología.
Con este equipo se puede secuenciar cualquier molécula de ADN, lo que permite abarcar gran cantidad de aplicaciones, entre las que cabe destacar:
PLATAFORMA C1 SINGLE-CELL AUTO PREP ARRAY (FLUIDIGM)
Permite la extracción, amplificación y preparación de ácidos nucleicos de célula individual para posteriores aplicaciones.
TERMOCICLADOR BIOMARK HD (FLUIDIGM)
Análisis de genotipado o expresión génica en formato tipo “array” de 48x48, 96x96 y bloque flexible de 6x6. Además permite la realización de PCR digital.
Es perfectamente compatible con el material genético obtenido tras el procesamiento de “célula individual” de la plataforma C1.
REQUERIMIENTOS PARA EL 3100 GENETIC ANALYZER (APPLIED BIOSYSTEMS)
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
El ADN ha de estar limpio y libre de contaminantes como sales, ARN o proteinas.
Para plásmidos la utilización de sistemas de purificación mediante columnas suelen ir bien para su posterior secuenciación. Si se utilizan métodos en que se precipita el ADN con etanol, es muy importante lavar el precipitado con etanol al 70%.
Para los productos de PCR es aconsejable separarlos en un gel de agarosa y la banda de interés debe ser recortada y el ADN extraido (elución, Geneclean, kit con columnas etc). Otro método sencillo es el de la Exo-SAP siempre que la banda sea única.
IMPORTANTE: resuspender el ADN siempre en agua estéril
CANTIDAD DE ADN REQUERIDA
La cantidad de ADN junto con la pureza de la muestra, son los factores más importantes que afectan a la caliad de los resultados. Si utilizamos una cantidad insuficiente de ADN, los resultados serán de mala calidad, pues la intensidad o altura de los picos del cromatograma serán muy bajos, pudiendose enmascarar con el ruido de fondo (picos inespecificos). Si la cantidad es excesiva, la secuencia no alargará lo suficiente pues los oligonucleótidos cebadores se terminarán en los primeros ciclos. Así pues es necesario una relación equilibrada de ADN molde y cebadores.
CONSEJO IMPORTANTE: una vez extraido el ADN es muy importante cuantificarlo cargando una alicuota en un gel de agarosa junto a un control de concentración conocida. Esto nos ayudará a calcular la concentración de ADN así como a estimar su calidad, podemos ver por ejemplo si está libre de ARN.
La cantidad de ADN aconsejada para una reacción de secuencia es la siguiente:
La cantidad de oligonucleótido cebador para una reacción de secuencia es de 3.2 pmol.
Los volumenes en que deben ir las cantidades mencionadas anteriormente se detallan en el apartado de envio de muestras.
IMPORTANTE: resuspender el ADN y el cebador siempre en agua estéril.
ENVIO DE LAS MUESTRAS
Como norma general las muestras deben llegar al Servicio de Secuenciación siguiendo las siguientes pausas:
Cuando sea el servicio quien añada los cebadores, en el eppendorf de la muestra sólo se entregará el ADN molde necesario en un volumen fijo de 5 µl en agua.
Las secuencias se enviarán al Servicio de Secuenciación de ADN, edificio Departamental, Avenida del Campo charro S/N, 37007 Salamanca.
PARA UTILIZAR EL SECUENCIADOR 454 ES NECESARIO CONTACTAR CON EL SERVICIO ANTES DE ENVIAR LAS MUESTRAS.